文獻內容講解

巨自(zi)噬（以下簡稱自(zi)噬）涉及(ji)膜的(de)初始形(xing)成，將細(xi)胞(bao)質(zhi)中需(xu)要(yao)分(fen)解的(de)物質(zhi)隔離形(xing)成雙膜自(zi)噬體(ti)，自(zi)噬體(ti)隨后與(yu)溶酶體(ti)接觸，進而融合，從而使物質(zhi)分(fen)解和由(you)此產生的(de)大分(fen)子循(xun)環，以在饑餓和細(xi)胞(bao)應激期間獲(huo)得穩態。

自噬體的生物(wu)發生通過ULK1激酶復合物(wu)和(he)III類磷脂酰(xian)肌醇3激酶復合物(wu)1(PIK3C3-C1)聚集到內質網(ER)相(xiang)關位點啟(qi)動，新形(xing)成(cheng)的自噬體即從這(zhe)些位點發出。自噬體膜很(hen)大程度上缺(que)乏跨膜蛋(dan)白(bai)，因此認為其形(xing)成(cheng)受膜相(xiang)關蛋(dan)白(bai)及其脂質組成(cheng)和(he)分布(bu)的調(diao)節(jie)。

前人研究表明(ming)，自(zi)(zi)噬體富含(han)不飽和脂(zhi)肪酸，而這(zhe)些脂(zhi)肪酸是自(zi)(zi)噬體形成所(suo)必需的(de)。這(zhe)些研究表明(ming)，降低(di)膜序有利(li)于自(zi)(zi)噬的(de)啟動，可(ke)能是通過產(chan)生已(yi)知的(de)自(zi)(zi)噬體形成所(suo)需的(de)柔性高度彎曲的(de)膜。除(chu)了磷脂(zhi)、膽固醇是哺乳動物膜的(de)一個重要組成部分(fen)，它的(de)豐度也是膜秩序和流動性的(de)決定因素。

細(xi)胞內膽(dan)(dan)固(gu)(gu)醇(chun)(chun)(chun)水平通過生物(wu)發生和(he)(he)細(xi)胞外(wai)膽(dan)(dan)固(gu)(gu)醇(chun)(chun)(chun)攝取進(jin)(jin)行雙重調節。除了低密度脂(zhi)蛋白(bai)(bai)受(shou)體(LDLR)途徑外(wai)，一(yi)(yi)些(xie)膽(dan)(dan)固(gu)(gu)醇(chun)(chun)(chun)轉(zhuan)運蛋白(bai)(bai)也被證(zheng)明直接從質(zhi)膜(PM)介導膽(dan)(dan)固(gu)(gu)醇(chun)(chun)(chun)的輸入和(he)(he)胞內轉(zhuan)運。這(zhe)(zhe)種膽(dan)(dan)固(gu)(gu)醇(chun)(chun)(chun)轉(zhuan)運蛋白(bai)(bai)例如 GramD 家(jia)族蛋白(bai)(bai)（由GramD1A、GramD1B、GramD1C（也稱(cheng)為(wei)ASTER蛋白(bai)(bai)）、GramD2和(he)(he)GramD3)，以其N-末端區域(yu)的脂(zhi)質(zhi)結(jie)(jie)(jie)合(he)PH相似結(jie)(jie)(jie)構(gou)域(yu)命名。在這(zhe)(zhe)5個成員中，只有GramD1A、GramD1B和(he)(he)GramD1C（這(zhe)(zhe)里統稱(cheng)為(wei)GramD1S)含(han)有一(yi)(yi)個與甾醇(chun)(chun)(chun)結(jie)(jie)(jie)合(he)的巨大結(jie)(jie)(jie)構(gou)域(yu)，允(yun)許它們(men)促進(jin)(jin)PM到(dao)ER膽(dan)(dan)固(gu)(gu)醇(chun)(chun)(chun)的輸入。

GramD1S的(de)(de)(de)缺失導致細(xi)(xi)胞膜中可及膽固(gu)醇(chun)的(de)(de)(de)積累,而GramD1A和GramD1B缺失的(de)(de)(de)小鼠巨噬(shi)細(xi)(xi)胞也表(biao)現出甾(zai)醇(chun)調節元件結合蛋(dan)白(bai)2(SREBP2)靶基因的(de)(de)(de)上(shang)調表(biao)達，表(biao)明ER膽固(gu)醇(chun)降低(di)。由于(yu)對(dui)GramD家族蛋(dan)白(bai)質的(de)(de)(de)研究數量有限，它們(men)的(de)(de)(de)生(sheng)物學重要性仍未深(shen)入了解(jie)。

膽固醇耗(hao)竭促(cu)進(jin)自噬啟動

此項研究用快速清除細胞(bao)膜中(zhong)膽(dan)固(gu)醇(chun)的(de)MBCD分析(xi)了膽(dan)固(gu)醇(chun)耗(hao)(hao)盡后饑(ji)餓(e)誘(you)導(dao)(dao)的(de)自噬(shi)的(de)短期影響。對照細胞(bao)相比，在(zai)基礎條件下，膽(dan)固(gu)醇(chun)耗(hao)(hao)竭導(dao)(dao)致(zhi)LC3B(LC3B-II)的(de)膜結合形式增(zeng)加了三倍，這(zhe)在(zai)缺乏膽(dan)固(gu)醇(chun)的(de)饑(ji)餓(e)細胞(bao)中(zhong)進一(yi)步增(zeng)強(qiang)；據內(nei)源性LC3B點狀體的(de)免疫熒光(guang)顯微鏡(jing)觀察，膽(dan)固(gu)醇(chun)耗(hao)(hao)竭增(zeng)加了Fed和Starved細胞(bao)中(zhong)自噬(shi)體的(de)形成。這(zhe)些結果表(biao)明(ming)，膽(dan)固(gu)醇(chun)耗(hao)(hao)竭促進自噬(shi)誘(you)導(dao)(dao)，并增(zeng)強(qiang)饑(ji)餓(e)誘(you)導(dao)(dao)的(de)自噬(shi)。

為了(le)闡明(ming)細(xi)胞(bao)膽固醇(chun)(chun)調節劑是(shi)(shi)否(fou)也(ye)(ye)影響自(zi)噬(shi)(shi)，設計實驗耗竭在膜接觸點作為非泡(pao)狀細(xi)胞(bao)器間(jian)膽固醇(chun)(chun)運(yun)動中介的膽固醇(chun)(chun)轉(zhuan)(zhuan)運(yun)蛋白。鑒于復合(he)物通過其C端區(qu)域22和GramD1A參與(yu)自(zi)噬(shi)(shi)，為明(ming)確GramD1A家族(zu)的其他成員(yuan)是(shi)(shi)否(fou)也(ye)(ye)參與(yu)自(zi)噬(shi)(shi)，用siRNA轉(zhuan)(zhuan)染穩定誘導(dao)表(biao)達自(zi)噬(shi)(shi)報告基因(yin)Mcherry-EGFP-LC3B（黃色自(zi)噬(shi)(shi)體(ti)，由于酸(suan)性(xing)溶酶體(ti)中EGFP猝(cu)滅而產生的紅自(zi)溶酶體(ti)）的U2OS細(xi)胞(bao)，分別(bie)耗盡每個Gram家族(zu)成員(yuan)。這些實驗數據表(biao)明(ming)，GramD1C介導(dao)的膽固醇(chun)(chun)轉(zhuan)(zhuan)運(yun)調節饑餓誘導(dao)的自(zi)噬(shi)(shi)。

U2OS細(xi)胞(bao)中(zhong)GramD1C耗竭導(dao)致(zhi)了(le)幾種早期自噬(shi)機制成分的增加，如(ru)ATG13、ATG16L1和PTDINs(3)P效(xiao)應蛋白WIPI2B40；而且與膽固醇耗竭細(xi)胞(bao)中(zhong)的結(jie)果(guo)一致(zhi)，研究發現(xian)GramD1C耗竭促進饑餓細(xi)胞(bao)中(zhong)EGFP-BAT的募(mu)集，這些結(jie)果(guo)提示GramD1C通過降低膜曲率(lv)抑制自噬(shi)體的啟(qi)動。

為了(le)研(yan)究GramD1C是否可能調節內(nei)質網和(he)線(xian)粒體之間的(de)膽固醇(chun)運動，我(wo)們在分離的(de)線(xian)粒體中加入重組Mcherry標記的(de)perfringolysin O(Mcherry-D4)膽固醇(chun)結合域，建立了(le)一種線(xian)粒體膽固醇(chun)定量方法。后續通過(guo)一系列實驗證明GramD1C是線(xian)粒體膽固醇(chun)豐度(du)和(he)線(xian)粒體生物能量學的(de)負調節因子。

Gram家族表達對CCRCC預后(hou)的(de)影響

通過(guo)TCGA數(shu)據庫分析腎透明(ming)細胞(bao)癌(KIRC)腫瘤基因(yin)表達(da)數(shu)據中完整(zheng)的(de)(de)Gram1C家族在CCRCC中的(de)(de)參與情況，及患(huan)者(zhe)生存(cun)(cun)的(de)(de)相關性(xing)，發現(xian)GRAMD1C、GRAMD2B是腎透明(ming)細胞(bao)癌(CCRCC)患(huan)者(zhe)預(yu)后的(de)(de)不(bu)利(li)因(yin)素；Gram家族成員(yuan)可能(neng)是通過(guo)調節新(xin)陳代謝(xie)和癌細胞(bao)存(cun)(cun)活(huo)率來調節CCRCC患(huan)者(zhe)的(de)(de)總存(cun)(cun)活(huo)率。