脊髓神經元原代培養細胞實驗

　　一、背景

　　神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)原代培養是將胚胎哺乳動物中樞神(shen)(shen)經(jing)系統的(de)(de)部分組織，如(ru)大(da)腦(nao)皮層、海馬(ma)、脊髓等腦(nao)組織直(zhi)接取出(chu)，再接種(zhong)培養的(de)(de)方法(fa)。目前國內、外(wai)(wai)有(you)關神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)培養的(de)(de)方法(fa)較多，但在原代培養中神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)的(de)(de)純度和(he)產量方面還存(cun)在一(yi)些急(ji)待解決的(de)(de)問題。由于(yu)神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)是一(yi)種(zhong)高度分化的(de)(de)細胞(bao)，相對于(yu)其它細胞(bao)而(er)言，神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)在體外(wai)(wai)更難以存(cun)活和(he)生長。因此(ci)，體外(wai)(wai)培養神(shen)(shen)經(jing)元(yuan)(yuan)要(yao)求(qiu)的(de)(de)培養方法(fa)和(he)營養條件均較為特殊。

　　神經細(xi)胞的(de)(de)體(ti)(ti)外(wai)(wai)培養(yang)(yang)技術(shu)是(shi)研究(jiu)神經源性疾病的(de)(de)發(fa)病機制、進程的(de)(de)一個重要(yao)工具，能很好的(de)(de)、直觀的(de)(de)反映離體(ti)(ti)神經元(yuan)的(de)(de)發(fa)育狀況和生理活性，如(ru)何建立一個穩(wen)定成熟的(de)(de)神經細(xi)胞培養(yang)(yang)體(ti)(ti)系是(shi)神經系統疾病體(ti)(ti)外(wai)(wai)實驗研究(jiu)順利進行的(de)(de)基礎。隨著(zhu)基礎醫學(xue)及臨床醫學(xue)研究(jiu)的(de)(de)逐漸深(shen)入，神經細(xi)胞的(de)(de)體(ti)(ti)外(wai)(wai)培養(yang)(yang)技術(shu)在腦(nao)損(sun)傷、神經障(zhang)礙(ai)性疾病、衰老相(xiang)關神經疾病方面得到廣泛重視和普及應用。

　　二、脊髓神經元原代培養細胞實驗實驗步驟

　　(1)75%(體積分(fen)數)酒(jiu)精消毒孕鼠,在無菌條件(jian)下取出胎(tai)鼠,分(fen)離并切取脊髓,置(zhi)于(yu)冷的無鈣、鎂的HBSS液的平皿(min)中(下置(zhi)冰袋)。

　　(2)解(jie)剖顯微鏡無菌(jun)條件下仔細剝(bo)離脊膜(mo)及血(xue)管(guan)。

　　(3)用彈簧(huang)剪(jian)將(jiang)脊(ji)髓剪(jian)成(cheng)1cm3大小，消化液37℃消化15-20min，每五分鐘振蕩一次；

　　(4)去掉上(shang)清，加入終(zhong)止(zhi)液終(zhong)止(zhi)消(xiao)化，吹打10-15次，不能有(you)氣泡，收集上(shang)清，剩(sheng)余組織再消(xiao)化一次。

　　(5)4℃1000rpm離心10min，棄上清，加入(ru)種植液(ye)1重懸，培(pei)養箱內差速貼(tie)壁(bi)30min；

　　(6)收集(ji)上清(qing)，臺盼藍染色計(ji)數，按6*105cells/孔種(zhong)入六孔板(ban)（種(zhong)植液1），37℃，5%CO2，95%飽和濕度的培養箱(xiang)中培養；

　　(7)培養(yang)第二天，全換(huan)液(ye)更換(huan)為(wei)種植液(ye)2；

　　(8)培養第(di)四(si)天，半量換液(ye)加(jia)入(ru)5uM的阿糖胞(bao)苷，24h全量換液(ye)；

　　(9)之后每周換液兩次。