大腦皮層神經元原代培養細胞實驗

　　一、背景

　　神(shen)經(jing)元原代培(pei)(pei)養是將(jiang)胚(pei)胎哺乳動物中(zhong)樞神(shen)經(jing)系統的(de)部分(fen)組(zu)(zu)織，如大腦(nao)皮層、海馬、脊髓(sui)等腦(nao)組(zu)(zu)織直接取出(chu)，再接種(zhong)(zhong)培(pei)(pei)養的(de)方法(fa)。目(mu)前國內、外有關神(shen)經(jing)元培(pei)(pei)養的(de)方法(fa)較(jiao)多，但在(zai)原代培(pei)(pei)養中(zhong)神(shen)經(jing)元的(de)純(chun)度和(he)產量方面(mian)還存(cun)在(zai)一(yi)些急待解決的(de)問題(ti)。由于神(shen)經(jing)元是一(yi)種(zhong)(zhong)高度分(fen)化的(de)細(xi)胞(bao)，相(xiang)對于其它細(xi)胞(bao)而言，神(shen)經(jing)元在(zai)體(ti)外更(geng)難以(yi)存(cun)活和(he)生長。因此，體(ti)外培(pei)(pei)養神(shen)經(jing)元要求的(de)培(pei)(pei)養方法(fa)和(he)營養條件均較(jiao)為特殊。

　　神(shen)經(jing)(jing)(jing)(jing)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)體外培(pei)養技(ji)術是研(yan)(yan)(yan)究(jiu)神(shen)經(jing)(jing)(jing)(jing)源性(xing)疾(ji)病(bing)的(de)發(fa)病(bing)機制、進程的(de)一個重(zhong)要工具，能很好(hao)的(de)、直(zhi)觀(guan)的(de)反映離體神(shen)經(jing)(jing)(jing)(jing)元的(de)發(fa)育狀況和生理活性(xing)，如何(he)建(jian)立一個穩定成熟的(de)神(shen)經(jing)(jing)(jing)(jing)細(xi)胞(bao)(bao)培(pei)養體系是神(shen)經(jing)(jing)(jing)(jing)系統疾(ji)病(bing)體外實驗研(yan)(yan)(yan)究(jiu)順利進行的(de)基礎(chu)。隨著基礎(chu)醫學(xue)及(ji)臨床醫學(xue)研(yan)(yan)(yan)究(jiu)的(de)逐漸深(shen)入(ru)，神(shen)經(jing)(jing)(jing)(jing)細(xi)胞(bao)(bao)的(de)體外培(pei)養技(ji)術在腦(nao)損傷、神(shen)經(jing)(jing)(jing)(jing)障(zhang)礙性(xing)疾(ji)病(bing)、衰老相關神(shen)經(jing)(jing)(jing)(jing)疾(ji)病(bing)方面得到廣(guang)泛(fan)重(zhong)視和普及(ji)應(ying)用(yong)。

　　二、大腦皮層神經元原代培養細胞實驗步驟

　　(1)75%(體積分(fen)數)酒(jiu)精(jing)消毒(du)孕鼠(shu),在無(wu)菌(jun)條件下取(qu)(qu)出胎鼠(shu),分(fen)離并切取(qu)(qu)大(da)腦皮層,置于冷(leng)的(de)無(wu)鈣、鎂的(de)HBSS液的(de)平皿(min)中(下置冰(bing)袋)。

　　(2)解剖(pou)顯微鏡無菌條件下仔細剝離大腦皮(pi)層(ceng)。

　　(3)用彈簧(huang)剪將大(da)腦皮層剪成1cm3大(da)小，消化液37℃消化15-20min，每五分鐘振蕩一次；

　　(4)去掉上清，加(jia)入終(zhong)止(zhi)液終(zhong)止(zhi)消(xiao)化(hua)，吹打(da)10-15次，不(bu)能有氣泡，收集(ji)上清，剩余組織再(zai)消(xiao)化(hua)一次。

　　(5)4℃1000rpm離心10min，棄上清，加入種植(zhi)液1重懸，培養箱內差速貼(tie)壁30min；

　　(6)收集(ji)上清，臺盼(pan)藍(lan)染色計數，按6*105cells/孔種入六孔板(ban)（種植(zhi)液1），37℃，5%CO2，95%飽和濕度的培養(yang)箱中培養(yang)；

　　(7)培養第二(er)天，全換(huan)液(ye)更換(huan)為種植液(ye)2；

　　(8)培養第(di)四天，半(ban)量換液(ye)加(jia)入5uM的阿(a)糖胞苷，24h全量換液(ye)；

　　(9)之后每周換液(ye)兩次。