海馬神經元原代培養細胞實驗

一、背(bei)景(jing)

神(shen)(shen)經元原代培(pei)(pei)養是將(jiang)胚胎哺(bu)乳動物中樞神(shen)(shen)經系(xi)統的(de)(de)(de)部分(fen)組織，如大腦皮層、海馬、脊(ji)髓等(deng)腦組織直接取出(chu)，再接種培(pei)(pei)養的(de)(de)(de)方法(fa)(fa)。目前國內、外(wai)有關神(shen)(shen)經元培(pei)(pei)養的(de)(de)(de)方法(fa)(fa)較多，但在原代培(pei)(pei)養中神(shen)(shen)經元的(de)(de)(de)純度和(he)產量方面還存在一些急待解決的(de)(de)(de)問題(ti)。由(you)于神(shen)(shen)經元是一種高度分(fen)化的(de)(de)(de)細胞(bao)，相(xiang)對于其它(ta)細胞(bao)而言(yan)，神(shen)(shen)經元在體外(wai)更難以(yi)存活和(he)生長。因(yin)此，體外(wai)培(pei)(pei)養神(shen)(shen)經元要(yao)求的(de)(de)(de)培(pei)(pei)養方法(fa)(fa)和(he)營養條件均(jun)較為(wei)特(te)殊。

神(shen)經(jing)細胞的體外(wai)培養技術是研究神(shen)經(jing)源性疾(ji)病的發(fa)病機制、進程的一個(ge)重(zhong)要工具，能很好的、直觀的反映離體神(shen)經(jing)元的發(fa)育狀(zhuang)況和生理活性，如何(he)建立一個穩定成熟的神經細胞培養體系是神經系統疾病體外實驗研究順利進行的基礎。隨著基礎醫學及臨床醫學研究的逐漸深入，神經細胞的體外培養技術在腦損傷、神經障礙性疾病、衰老相關神經疾病方面得到廣泛重視和普及應用。

二、海馬神經元原代培養細胞實驗步驟

(1)75% (體積分數)酒精消毒孕鼠,在無(wu)(wu)菌(jun)條件下取出胎鼠,分離并去除(chu)海(hai)馬,置于冷的無(wu)(wu)鈣、鎂的HBSS液的平皿中( 下置冰袋)。

(2)解剖顯微鏡(jing)無菌條(tiao)件下(xia)仔(zi)細剝離海馬。

(3)用(yong)彈簧剪(jian)將海馬剪(jian)成1cm3大(da)小，消(xiao)化液37℃消(xiao)化15-20min，每(mei)五(wu)分(fen)鐘振蕩一次；

(4)去掉上清，加(jia)入終止液終止消化，吹打10-15次，不能有氣泡，收集上清，剩余組(zu)織再消化一次。

(5)4℃1000rpm離(li)心10min，棄上清，加入種植液1重懸，培(pei)養(yang)箱內(nei)差(cha)速貼壁30min；

(6)收集(ji)上清，臺盼藍染色計數，按6*105cells/孔(kong)種(zhong)入(ru)六(liu)孔(kong)板(ban)（種(zhong)植液1），37℃，5%CO2，95%飽和濕度的培養箱中(zhong)培養；

(7)培養第(di)二(er)天，全換液更(geng)換為種植液2；

(8)培(pei)養第四天，半量換(huan)(huan)液加(jia)入5uM的阿糖胞苷，24h全(quan)量換(huan)(huan)液；

(9)之后每周換液兩次。